骨代谢相关通路及信号分子的研究进展
骨质疏松是一种以骨量降低和骨脆性增加为特征的骨病，每年世界范围内有超过9百万例骨质疏松性骨折，并由此产生巨大的医疗花费。正常情况下骨量维持有赖于骨吸收与骨形成之间平衡的维持，多种因素可打破这一平衡，目前认为年龄相关的骨代谢水平改变及绝经后雌激素水平下降、男性睾酮生成减慢是原发性骨质疏松发生的主要原因。最初抗骨吸收药阿伦唑奈等进入临床应用并取得一定疗效，但同时也面临抗骨形成、不能改善骨小梁微结构等问题，随着对骨代谢相关通路研究的深入，新的更具针对性的药物如狄诺塞麦、硬化蛋白抗体等已进入临床试验[2]。对骨代谢相关通路的研究为骨质疏松的治疗提供了更多潜在的靶点。本文就骨代谢相关通路及信号分子展开综述。
一、Wnt通路
Wnt通路包括参与信号转导的Wnt蛋白，卷曲蛋白(Frz)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)，β-连环蛋白，T细胞因子/淋巴增强因子(TCF/LEF)，以及参与通路调控的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、轴蛋白(Axin/Conductin)、腺瘤样结肠息肉蛋白(APC)、散乱蛋白(DSH)、酪蛋白激酶α。其中卷曲蛋白与LRP5/6形成Wnt蛋白的共受体，GSK-3β、Axin、APC、酪蛋白激酶α组成降解复合体，调节胞内β-catenin水平。
β-catenin是经典通路中调节成骨分化的关键因子，其N端富含丝氨酸、苏氨酸，为降解复合物结合位点，C端为TCF/LEF结合位点。Wnt/β-catenin通路处于失活状态时，β-catenin与降解复合物结合，并被GSK-3β磷酸化，进而经泛素化后被降解，使细胞质内β-catenin处于较低水平。当Wnt蛋白与Frizzled蛋白、LRP5/6结合后，DSH可与APC竞争性结合GSK-3β，导致降解聚合物解聚，GSK-3β失活，使β-catenin在细胞质内稳定存在，并向细胞核内转移，通过其C端与转录因子TCF/LEF结合，正性调节Runx /Cbfα 转录因子家族基因的表达，CBFα1/RUNX2能通过诱导间充质干细胞早期分化及抑制其后期凋亡促进成骨分化，在成骨细胞中CBFα1与骨桥蛋白、骨唾液蛋白、骨钙素基因、胶原蛋白1a启动子结合，发挥调控骨发育的作用。
Wnt非经典途径包括Wnt-平面细胞极性(PCP)途径，Wnt-钙离子途径，需要钙离子、cGMP等第二信使参与信号转导，影响过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、RUNX2、活化T细胞核因子(NFATC1)等关键分子的活性。近来，Wnt非经典通路在骨代谢中的作用越来越被重视。Kazuhiro Maeda发现，Wnt5a可以通过酪氨酸激酶孤受体(Ror)激活JNK通路，募集c-jun至核因子κB受体活化因子(RANK)靶基因启动子，介导破骨细胞分化。而GWAs和动物实验证实Wnt16及Wnt4能通过增加骨保护素(OPG)和抑制κ基因结合核因子(NF-κB)活性发挥骨保护作用。
硬化蛋白是一种天然的Wnt通路拮抗剂，由SOST基因编码，在骨组织中高表达，负性调节骨分化过程。长期卧床及雌激素水平下降均会引起硬化蛋白表达增加。雌激素不能单独调节硬化蛋白表达，但可通过BMPs通路和Wnt/ERα及Wntt经典通路，改变RANKL/OPG比，影响硬化蛋白表达。除雌激素的间接作用外，GWASs研究表明，MEF2C可直接增加SOST表达。目前针对硬化蛋白的抗体已进入三期临床试验。一项多中心研究显示，硬化蛋白抗体romosozumab显著提高绝境后骨质疏松患者腰椎骨密度(较基线增加11.3%)，并且这一效果优于阿伦唑奈和特立帕肽(较基线增加4.1%和7.1%)。而血清骨形成标志物P1NP在短期内迅速增加，并伴随骨吸收标志物水平下降。在试验过程中未见严重用药副作用，仅有少量轻度注射反应。
除硬化蛋白外，Wnt通路还受到分泌型卷曲蛋白相关蛋白(SFRP4)、阻黑蛋白(DKK1)、RSPO3调控。SFRP4与Wnt蛋白结合、DKK1与LRP5/6聚合体结合抑制Wnt通路的激活，而RSPO3可以拮抗DKK1的抑制作用。
叉形头转录因子家族(FOXO)参与细胞自我更新、增殖、生存等过程。生理条件下，FOXOs被PI3K/Akt抑制，氧化应激状态或生长因子缺失可引起FOXOs转移至核内，使Wnt-βcatenin-TCF/LEF通路转向Wnt-βcatenin-FOXO-PPARs。在细胞分化不同时期，FOXOs产生不同的生物学效应。在间充质干细胞阶段，FOXO可上调RUNX2表达，促进分化，在成骨细胞前体细胞中，通过抑制Wnt通路抑制细胞增殖，在成熟成骨细胞中主要抑制氧化应激对细胞的损伤作用。
细胞信号通路相互关联构成网络，在成骨细胞中，Wnt经典通路的靶基因之一Jag1编码的JAG1是NOTCH信号通路的重要配体，因而成为NOTCH与Wnt通路关联的重要节点。而Wnt通路也受到其他信号通路的调节。Wnt通路活化过程中需要钙通道的开放和PKC/ERK的参与，钙通道蛋白需要在特定半胱氨酸位点发生巯基化才能发挥生物学作用，内源性硫化氢是巯基化必需的物质，雌激素通过上调胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ裂解酶(CSE)水平增加细胞内硫化氢水平，从而实现对Wnt通路的调控。
二、BMP通路
骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一员，通过经典的BMP/Smad通路和非经典MAPK通路影响RUNX2及Osterix等转录因子的表达，从而达到调节骨代谢、细胞分化的作用。BMPs常以同源二聚体的形式存在并发挥效应，根据氨基酸和核苷酸相似性将BMPs分为4个亚族：BMP2/4,BMP9/10,BMP5/6/7/8,BMP12/13/14。目前已证实BMP2与BMP7在促进骨愈合方面具有良好的安全性和有效性，并进入临床使用，而BMP3和BMP13被证实是骨生长的负性调节分子。BMPs受体属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体，分为1型受体(BMPRIA、BMPRIB、ACVRI)和2型受体(BMPRII，ActrIIA 和ActRIIB)，BMP配体在细胞外与2型受体结合，磷酸化1型受体激活下游R-Smads(Smad1,5,8)，R-Smads与Co-Smads形成复合物转位至细胞核内，启动Runx2及Osterix等靶基因转录，促进成骨分化。
除BMP-smad经典途径外，BMP还可以通过BMPR1A可以募集Tab1-Tak1复合物，短时间内激活Tak1/2-Mek1/2-Erk1/2信号通路，调节P16INK4a等靶基因表达，影响成骨分化过程。这一途径受酪氨酸激酶c-Abl调节。C-Abl通过磷酸化BMPR1A羧基端特定的酪氨酸残基，促使BMPR1A与BMPR2相互作用，激活BMP-smad通路。
BMP通路的促成骨分化作用与组蛋白去甲基化有关。Ling 发现BMP4/7可通过Smad上调间充质干细胞中去甲基酶KDM4B和KDM6B，这两种去甲基酶通过移除H3K9m3和H3K27m3、募集RNA聚合酶启动DLX与HOX的表达，进而启动成骨分化相关的RUNX2与SP7(OSX)的转录，同时增加BMP2、BMP4的表达，形成正反馈调节。
雌激素可以通过调节BMP的表达影响BMP通路的信号传递，这一过程可能需要GATA4的参与。GATA家族是一类与DNA (A/T)GATA(A/G)序列结合的转录因子，GATA4被认为与成骨细胞分化相关，其表达受ERα调节，是雌激素调节TGFβ/BMP/Smads的关键因子。GATA4表达受雌激素信号通路调节，并协助雌激素受体与DNA结合，启动或抑制靶分子如BMP4、BMP6、TGF/2/3、BMP受体的转录。
三、RANKL通路
NF-κB是参与免疫和细胞应答的重要转录因子。在哺乳动物中，NF-κB家族包括RelA (p65), RelB,和 c-Rel, 以及前体蛋白NF-κB1(p105)和NF-κB2(p100)，后两种可被加工成p50 和p52。经典途径中，IKKβ和NEMO引起IκBα磷酸化和P65/P50异源二聚体向核内转位。非经典途径中NIK与IKKα磷酸化P100，并将其加工为P52，释放RelB/P52复合物。TNF家族如RANKL、TNF、淋巴毒素β、CD40L均可调节NF-κB通路。其中，RANKL可以通过肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)及NIK分别参与NF-κB经典和非经典途径的调控。
既往针对TRAF家族的研究表明，TRAF2,5,6在NF-κB途径中起正性调节作用。TRAF3最早被认为对B细胞中NF-κB通路具有负性调控作用。在此基础上，Yan发现，TRAF3同样对破骨分化具有抑制作用，一方面TRAF3可以抑制NIK-IKKα通路，另一方面，可以上调NF-κB途径负性调节分子1型IFN的表达。而在NF-κB激活过程中，RelB作为转录因子可启动自噬蛋白Beclin-1(BECN1基因编码)的转录，通过自噬/溶酶体降解TRAF3。进一步研究发现，抗疟药氯喹可以保护TRAF3不受溶酶体降解，进而抑制破骨细胞分化，这为骨质疏松药物的开发提供新的途径。
信号传导及转录激活因子(STAT)家族广泛参与破骨细胞分化过程，已证实，β干扰素和白介素4 通过STAT1、STAT6负性调节破骨细胞分化过程。据此，Jun Hirose提出破骨细胞存在负反馈调节机制，并在试验中证实RANKL在介导破骨细胞分化的过程中会引起白介3表达增加，激活STAT5，上调Dusp1和2的表达，使MAPK通路去磷酸化，从而负性调节破骨分化过程。
Riku认为骨代谢的动态平衡本质是成骨细胞分化，成骨细胞依赖的破骨细胞分化及破骨细胞分化三者的平衡。Ebf1和Zfp521的相互作用调节这一平衡。在成骨细胞中，Zfp521可抑制RANKL的表达，而在破骨细胞中，Zfp521通过NuRD与Ebf1结合，抑制Ebf1靶基因Ccl9的表达，而Ccl9与其受体Ccr1可以加强RANKl通路的信号转导。
在破骨分化过程中，基因表观调控同样起重要作用，Keizo 发现，RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)可以引起单核巨噬细胞前体细胞(BMMs)向破骨细胞分化，在这一过程中，DNA从头甲基化转移酶(Dnmt)转录水平显著增加。通过建立Dnmt3a和Dnmt3b敲除的胚胎干细胞模型，进一步证实，Dnmt3a在CD11b阳性的破骨前体细胞向破骨细胞分化阶段起主要作用。基因组存在特定基因如Irf8可以抑制破骨细胞分化，生理情况下RANKL作用与破骨细胞可引起Dnmt3a表达，并通过上调三羧酸循环增加ATP的合成，在甲硫氨酸腺苷转移酶(Mat)作用下生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，Dnmt3a与甲基供体SAM共同引起Irf8 转录因子甲基化，抑制Irf8表达。Rajavelu发现植物多酚可以抑制DNA甲基化，这对骨质疏松药物的研制具有借鉴意义。
与Wnt通路相似，RANKL-RANK通路也存在天然拮抗剂OPG，OPG是肿瘤坏死因子受体超家族成员，它最主要的生物学作用是抑制体内破骨细胞的分化、活化，并促进其发生凋亡，这一效应是通过竞争性与RANKL结合抑制RANKL通路的活化完成的。既往认为OPG由成骨细胞和骨细胞分泌调控骨转化，但最近研究证实淋巴细胞是骨髓中主要的OPG来源。Luo提出，破骨细胞还存在RANKL的第二受体，即富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4(LGR4)，可以与RANK竞争性结合RANKL后激活GSK-3β和Gαq-钙离子途径抑制T细胞活化核因子1(NFATC1)的表达。
四、NOTCH通路
NOTCH是调节细胞生命进程的进化保守的信号受体，包括NOTCH1-4 4种亚型，分为胞外结构域，跨膜结构域和胞内结构域NICD，配体为JAG1，JAG2，Delta样1,3,4，表达受Wnt等信号通路调控。重组信号结合蛋白jκ(RBPjκ)是NOTCH通路下游重要的转录因子。NOTCH未激活状态下，RBPjκ与转录抑制因子结合，阻止靶基因转录。NOTCH与配体结合后，受γ-分泌酶水解作用释放NOTCH胞内段(NICD)，NICD向核内转移，与RBPjκ结合，使其 与转录抑制因子解离，启动靶基因Hes1，Hey1 等的表达。
在成骨细胞中，NOTCH可以抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，促进成骨细胞成熟，这一作用与HES蛋白对成骨细胞的吻合。既往研究显示，Hes1转基因小鼠表现为成骨不全，但在成熟成骨细胞中条件敲除Hes1可增加骨矿化。
系统性慢性炎症反应可引起骨量丢失，比如类风湿性关节炎患者常伴有明显骨质疏松，这一现象与炎性因子对骨代谢的调节有关。已证实炎症因子如IL1,6，TNFα可以诱导破骨细胞分化，除此以外，TNFα等还可以通过NOTCH影响成骨细胞分化。Zhang发现，P52/RELB可以与NICD结合，增强RBPjκ对靶基因转录的启动作用，而TNFα可以上调NF-κB的表达。通过γ-分泌酶抑制剂阻断NOTCH通路可以增加动物模型的骨密度，这为治疗骨质疏松提供新靶点。
五、雌激素信号通路
雌激素是最主要的雌性激素，在生殖系统和非生殖系统中均具有重要作用，目前认为雌激素功能及水平的异常改变是帕金森病、阿尔兹海默症、骨质疏松等年龄相关疾病的病因之一。雌激素受体分为核受体ERα、ERβ和膜受体GPR30和ER-X。根据雌激素及其受体的效应机制将雌激素信号通路分为以下4类：
1、雌激素受体依赖核启动的信号途径
雌激素扩散进入细胞内，与细胞质及核内的ERα、β结合，使其形成同源或异源二聚体，通过其DNA结合区域(DBD)直接与靶基因启动子上的雌激素应答元件(EREs)结合并募集辅助激活因子启动靶基因转录。此外，激活的雌激素受体还可与转录因子如刺激蛋白SP-1、活化蛋白AP-1、NF-κB、c-jun结合，影响其转录活性。
2、雌激素受体依赖膜启动的信号途径
雌激素与细胞膜上的ER或GPR30结合，可在数秒钟内改变酪氨酸激酶受体、胰岛素样生长因子受体、神经突触受体，继而通过Ras/Raf/MEK/ERK、或PI3k/Akt/m-TOR改变靶基因转录因子活性。
3、非雌激素受体依赖途径
雌激素的酚环结构可以抑制损伤线粒体释放ROS，这一过程不需要雌激素受体的参与。此外，既往研究发现，在雌激素受体敲除的乳腺癌细胞中，雌激素仍可促进癌细胞增殖，提示雌激素可以不依赖雌激素受体发挥生物学效应。
4、非配体依赖的ER激活
ER可以被雌激素以外的多种细胞因子如神经递质，表皮生长因子，胰岛素样生长因子激活，并可以被多种细胞内信号通路激活剂如MAPK，PKA，PKC等，这种激活过程有赖于ER的磷酸化。比如EGF磷酸化ERα AF-1的Ser118，PKA磷酸化DBD区Ser236，激活其转录活性。
雌激素具有抑制高水平骨转化的作用，这一过程与ERα有关。ERα缺失的小鼠往往呈现出明显骨量丢失，通过基因编辑证实雌激素可以通过ERE影响骨转化过程，但Windahl发现，过表达ERE并未显著改变机械负荷引起的成骨分化的改变，而ERα缺失或AF-1区域的失活可以导致成骨分化障碍，这表明雌激素可通过多种途径而非单纯影响ERE来发挥骨保护作用。
骨是一个持续处于动态变化的器官，骨代谢的平衡有赖于骨形成与骨吸收的协调统一，这一过程不仅需要细胞内多条信号通路的交联，更需要细胞间的信息交流。IGF-1和TGFβ是公认的协调骨吸收与骨形成的信号分子，近来研究发现，骨形成过程中破骨细胞前体细胞分泌PDGF-BB可以促进内皮细胞迁移和增殖，促进血管形成和骨发生。免疫系统在骨代谢中的作用也越来越被重视，B细胞和T细胞合成的IL17、IL1、IL6、TNFα可以上调RANK的表达，而Th17细胞可直接参与破骨细胞分化。信号素家族的分泌型蛋白在骨代谢中发挥多重作用，sema4d与CD14+的单核细胞表面受体CD72结合可促进IL1等炎性因子的分泌，而sema3a一方面可以强化成骨细胞Wnt经典通路，另一方面可与Neuropilin1结合，破坏plexin2与髓细胞表达触发受体-2(TREM)和DNAX激活蛋白12(DAP12)的聚集，抑制免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的磷酸化，从而抑制ITAM信号通路介导的破骨分化。此外，骨髓中的脂肪细胞也参与构成骨代谢微环境。脂肪细胞和成骨细胞均由间充质干细胞分化产生，生理条件下处于此消彼长的动态平衡，PPARs参与调控体内脂质和能量代谢，并且不同的亚型具有不同的生理效应，研究证实PPARγ可以抑制Wnt经典途径，促进成脂分化，PPARβ/δ可以强化Wnt通路，调整RANKL/OPG比，恢复骨转化平衡。衰老、氧化应激、雌激素缺乏、服用糖皮质激素等可以激活Wnt-FOXO-PPARγ通路，使成骨分化向成脂分化转变，使骨组织中脂肪增加而骨形成减弱。同时脂肪细胞合成的瘦素可以抑制骨形成，导致骨质疏松的发生。
长久以来，骨质疏松症由于其较高的发病率和死亡率已成为严重的公共卫生问题，据统计，在50岁以上的人群中，有1/3的女性和1/5的男性存在骨质疏松，而其中有20%左右的老年患者会因股骨颈骨折死亡。自1995年阿伦唑奈投入使用，数十年来已有多种不同药理机制的药物应用于骨质疏松的预防和治疗。随着骨代谢相关通路研究的深入，抗骨质疏松药物的研发也越来越具有针对性，从最初阿伦唑奈及特立帕肽的经验性用药到2010年第一次针对RANKL通路研发狄诺塞麦，对骨质疏松发病机制的研究为治疗提供了潜在的药物作用靶点，为治疗骨质疏松以及类风湿性关节炎、促进骨折愈合提供新的可能。
本文来源于中国骨质疏松杂志微信公众平台，作者：庞新岗 等 。节选自《中国骨质疏松杂志》文章，参考文献略。感谢作者分享！
原文链接：http://mp.weixin.qq.com/s/xKvD80OUkQLg4ngzJo6TxQ
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